V. HPLC Troubleshoot [ HPLC 사용시 문제해결방법 ]

0. 서론

1. Leak

2. 압력문제

3. Retention-time 문제 #5-8

4. Baseline noise

5. Baseline Drift

6. Peak Problem

7. Sensivity Problem

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6. Peak Problem

피크의 모양에 관련된 문제는 접근과 문제점을 바로 잡는 것이 모두 어렵다.

피크 모양에 관련된 문제점은 결과 데이터에 영향을 줄수 있기 때문에, 분석 결과를 문제 해결하지 이전의 결과와 실제로 일치하는지 결정해야 한다. 

(1) Peak 갈라짐과 Shoulder

Peak의 갈라짐이나 Shoulder의 발생은 프릿이 막히거나 결함이 있는 가드 컬럼 또는 컬럼의 빈 공간때문이다.

이동상의 불순물을 거르기 위해 Injector 바로 뒤에 0.2-0.5um 의 in-line 필터를 사용하는 것을 추천한다.

이것이 고쳐지지 않으면 가드컬럼을 교체하고, 문제가 지속되면 컬럼을 교체해야 한다.

크로마토그램상에서 하나 또는 두 개의 피크만이 갈라진다면 시료가 녹지 않았거나 방해물질이 있기 때문이다.

알 수 없는 피크를 분석하기 위해 이동상의 성분을 교체할 수 있다. 또한 분석전에 시료준비과정을 재검토하면 문제가 제거될 수 있다.

(2) Peak Broad와 Fronting

피크가 넓어지거나(Broad) 앞쪽으로 기울게 되는 것 (fronting)은 시료의 농도가 진해서이다.

시료를 10~20배로 희석하고 다시 재주입하면 적절하게 변할 것이다. 크로마토그램 전반에 걸쳐서 뾰족해진 피크는 고농도의 시료 때문인 것을 확인 할 수 있다. 차후 비슷한 문제를 방지하기 위해서는 실험방법과 시료준비과정을 조정한다.

(3) Peak 겹침에 의한 영향

빨리 용출되는 피크가 더 뒤에 나오는 피크에 영향을 준다면 컬럼 이외의 영향(extra-column effect)이거나 주입시 사용된 용매에 관련된 문제이다.

컬럼 이외의 영향은 시스템의 과도한 데드볼륨(dead volume) 때문이다. 적당한 내부직경인지 확인하기 위해 시스템내의 관을 자세히 검사한다. 적당한 부피인지 확인하기 위해 흐름 장치를 검사하고, 알맞은 샘플rate의 값을 설정하기위해 데이터 운용 시스템을 확인한다. 이 문제가 지속된다면 주입시 사용되는 용매의 농도와 시료의 크기를 확인한다.

고농도의 용매는 시료가 이동상과 재평형을 이루어 컬럼의 처음부분을 지나 빠르게 이동하도록 하기 때문에 피크가 넓어지거나 나뉘어진다. 이런 문제를 피하기 위해서는 실험을 시작할 때 사용하는 이동상과 함께 시료를 주입하는 것이 최선이다.

밴드가 넓게 퍼지는 것은 컬럼의 분해나 오염물질 때문이다. 컬럼의 효율이 낮다면 진한 컬럼을 교체하기 전에 강한용매로 세척한다. 컬럼이 잘 작동하고 있다면, 문제점은 분분적으로 삽입된 인-라인 필터, 주입장치 또는 디텍터의 문제, 또는 잘못 설치된 튜빙과 관련되어 있을 것이다.

이러한 문제점들은 너무 높은 압력, 틈, 또는 일정치 못한 용매의 흐름과 같은 다른 징후들도 나타내게 될 것이다.

(4) Peak tailing

Peak Tailing은 보통 분석물에 있는 염기성 기능 그룹 (예를 들어 아미노그룹)과 컬럼의 충진 물질에 있는 결합되지 못하고 노출되어 있는 실라놀과의 상호작용에 의한 지연때문이다.

이러한 형태의 상호작용에 의한 tailing 피크는 20-30mM의 낮은 농도의 트리에틸아민 (TEA)과 같은 이동상 개선제를 사용하는 것으로 최소화 할 수 있다. 단, 이러한 종류의 이동상 modifier의 사용은 컬럼을 되돌릴수 없게 변화시켜, 이와 비슷한 modifier를 사용하지 않는 분석에는 컬럼을 사용하지 못하게 할 것이다.

Ion-paring 시약, 샘플 파생물 그리고 강한 완충제도 역시 peak tailing을 감소시킨다.

대안으로서 새로운 ultrapure base-deactivate column (초순수 염기-불활성 컬럼)을 사용할 수 있다. 이러한 컬럼은 염기성 물질 분석에서 좋은 모양의 피크를 만들기 위해 이동상 개선제를 사용할 필요가 없으며 Vydac의 MS, EVEREST, DENALI, 그리고 GENESIS HPLC 컬럼이 출시되어있다.

(5) Ghost Peak

유령 피크 (ghost peaks)는 알 수 없는 것에서부터 나타난 가짜 피크이다.

이러한 유령 피크들이 원인중 하나는 샘픔과 이동상에 녹아있는 공기양의 차이이다. 이러한 문제점은 이동상과 샘플 모두 인-라인 진공 기체제거 장치를 사용하여 기체를 제거하는 것으로 바로잡을수 있다.

UV 디텍터를 이용했을 때, 유령 피크는 훨씬 많이 나타나며, 일반적으로 낮은 파장대에서 더 크게 나타난다.

산소가 ACN에 대한 용해도가 더 낮기 때문에 이동상의 메탄올을 ACN으로 대체하는 것은 매우 효과적이다.

유령 피크는 반사 영향, 컬럼의 오염, 이동상의 오염, 자동 주입장치의 오염 또는 세척 용매의 오염, 또는 이동상 성분이나 용매필터에서의 미생물의 성장 등으로부터 발생될 수 있다.