IV. HPLC Troubleshoot [ HPLC 사용시 문제해결방법 ]

0. 서론

1. Leak

2. 압력문제

3. Retention-time 문제 #1-4

4. Baseline noise

5. Baseline Drift

6. Peak Problem

7. Sensivity Problem

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3. Retention time 문제 #1-4

Retention time 변화에 관련된 문제해결 과정에 대하여 시작하기에 앞서, 발생하는 문제가 같은 패턴으로 나타나는지 확인하기 위해 여러 번 반복 실험을 통해 지연 시간을 비교해 보고, 변화하는 패턴이 있는지에 대해 결정해야 한다.

(1) Retention time의 다양한 변화

Retention time의 다양한 변화는 이동상의 속도, 이동상의 조성, 컬럼의 정지상, 컬럼 온도 등의 변화에 의해 유발된다.

컬럼 void volume에서의 retention time = t0 이 바뀌었음에도 컬럼의 구성에 변화가 없다면, 문제점은 유속과 관련이 있는 것이다. 시스템의 누수와 펌프내에 있는 공기 방울이 t0를 증가시킨다.

문제점을 해결하기 위해서 앞 페이지에 설명한 낮은 유속 문제에 있는 방법을 따라하면된다. 유속의 증가는 t0를 감소시킨다. 펌프 조절장치에서 적합한 유속을 선택하였는지 확인하고, 펌프의 유속 정확성을 낮은 유속문제 부분에서 설명한것과 같은 방법으로 확인한다.

(2) 모든 Peak의 일괄적인 Retention time 이동

t0의 변화 없이 모든 피크가 같은 방향으로 이동한 것은 이동상에서의 변화를 나타낸다.

이러한 변화는 종종 증발이나 적절치 못한 혼합으로 인해 적어도 하나의 액체 이동상의 성분이 감소됨으로 발생된다. 이동상이 의심스러울때는 새로은 이동상을 만들어 문제점이 해결되는지 알아보아야 한다.

헬륨을 이용하여 기체를 제거한 용매는 휘발성이 높은 용매의 증발을 야기할 수 있어서 이동상의 농도에 영향을 주게 된다. 따라서 용매의 기체 제거는 헬륨을 사용하는 것 보다는 인라인 HPLC 용매 기체제거 장치를 사용하는 것을 권장한다.

(3) 특정 peak의 retention time 변화

특정 피크의 지연 시간이 변하였을 때 가장 기본적인 문제 원인은 이동상의 pH와 완충제의 농도와 관련되어 있다.

pKa에 의하면, 이온화되는 화합물의 지연시간은 이동상의 pH가 0.1 정도만 변하게 되어도 10%가 이동될 수 있다.

수용성 요소들만의 pH를 측정하고 있지만, 유기 용매의 첨가로 pH가 바뀔 수 있다는 것을 명심해야 한다.

Buffer의 농도는 일반적으로 20-50mM이 되어야 한다. 더 낮은 농도는 재현성이 낮은 결과를 주고, 높은 농도는 컬럼의 수명을 감소시킨다.

(4) Column 평형화 (Equilibration)

(1) 샘플을 주입하기 전에, 이동상으로 컬럼을 완전히 평형상태로 만드는 것은 재현성 있는 지연시간을 얻는데 매우 필수적이다.

: 적절한 컬럼 평형은 문제점 개선을 보기 위해 평형 시간을 길게 하는 것으로 결정한다.

: 샘플을 주입하기 전에 적어도 컬럼 부피의 10-15배의 용매를 컬럼에 흘려준다.

: 온라인으로 연결된 용매 혼합 장치를 이용할 때는 손으로 섞어서 만든 이동상의 결과와 비교해야 한다.

: Gradinet 조건에서는 용매 주입 라인을 교환하고 적합한 프로그램을 만들어야 한다.

만일 시스템이 바르게 작동 된다면 모든 Chromatography결과 동일하게 나타나야 한다.

(2) Retention time이 밀리는 것은 처음 몇 개의 샘플을 분리하는 동안 관찰할 수 있다.

만일 Retention time이 이동하고, 몇 개의 시료 주입 후 안정화 된다면, 샘플을 컬럼에 주입하는 동안 컬럼을 불활성화가 나타났을 수 있다. 만일 샘플의 공급이 제한되지 않고 결과로 나타난 크로마토그램이 괜찮다면 문제가 되지 않는다.

다른 방법으로는, 다른 화학적 성질을 가지는 컬럼, 샘플 전처리 과정에서의 변화, 또는 이동상 modifier가 이러한 현상을 없애는데 도움을 줄 수 있다.

(3) 만약 ion-paring시약과 같은 이동상 modifier가 사용했다면, Retention time이 밀리는 것은 컬럼이 불완전한 평형상태로 인해 나타난 결과일 수 있다.