IV. HPLC Troubleshoot [ HPLC 사용시 문제해결방법 ]

0. 서론

1. Leak

2. 압력문제

3. Retention-time 문제

4. Baseline noise

5. Baseline Drift

6. Peak Problem

7. Sensivity Problem

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0. 서론 : HPLC의 문제해결을 위한 4단계

1. 여러 문제점은 언제나 재발할 수 있음을 명심하시오.

   항상 문제가 발생한 위치를 찾고 해결하는 것은 어려운 일이다.

2. 문제점을 찾으시오. 가능한 문제점의 원인을 제거할 수 있는 방법을 생각하시오.

3. 문제 지점을 찾게 되면 문제 해결에 직접적인 관계가 있는 하나의 조건을 바꾸면서 확인하시오.

4. 문제가 해결되면, 해결책을 기술하시오.

   이것이 나중에 비슷한 문제점이 발생했을 경우, 문제점을 해결하는데 필요한 시간을 단축시켜 줄것이며,

   이러한 노트는 시스템을 유지시키는 프로그램을 만드는 일에도 도움을 줄것이다.

   각각의 HPLC 장치마다 이러한 노트를 비치하는 것은 매우 실용적이다.

1. Leak

Leak (= 샘, 누수)는 가장 발생하기 쉬우며 또한 바로잡기에 가장 간단한 문제점이다.

Leak가 발생했을 때는 시스템의 압력이 떨어지게 된다.

피팅에서 발생한 누수는 피팅을 단단히 조임으로 해결할 수 있다.

그러나 피팅을 다시 조이기 전에 분리하여 입자들이나 잔류 buffer들의 제거해주는 것이 필요할 수 있다.

이러한 방법으로 leak가 해결되지 않는다면, 다른 피팅으로 대체하는 것 이 가장 좋은 방법이다.

디텍터 셀, 펌프의 헤드, 그리고 주입 벨브와 같은 다른 위치에 생긴 누수는 다시 조립하거나 다른 마개로

대체하는 것이 좋을 것이다.

2. 압력문제

(1) 시스템 압력의 변화

압력문제는 시스템의 압력의 변화로 알 수 있다.

주어진 분석 방법이나 시스템 조건에 대한 표준 작동 압력은

시스템 압력 문제가 있는 것을 측정하기 위해 기록하고 참고로 사용해야만 한다.

높은 압력은 시스템 요소들 (컬럼 길이, 직경과 입자크기)의 변화, 유속에서의 부주의한 변화, 이동상의 조성 변화,
또는 시스템 내에 입자들이 생성되는 경우에 발생된다. 다른 값들을 수정하기 전에 컬럼 설명서, 이동상의 조성과
유속을 먼저 확인할 것을 명심해야 한다.

(2) 미세입자

미세입자들은 일반적으로 시료들, 이동상 또는 펌프 막개와 같은 시스템 구성요소의 마모로 발생된다.

높은 압력을 야기시키는 문제점을 해결하는 가장 빠른 방법은 시스템 압력에 가장 큰 영향을 주는 구성요소로부터
확인하는 것이다.

이런 요소는 우선 인라인 필터 또는 가드 컬럼, 그다음으로는 분석용 컬럼이 포함된다. 각 요소들을 잘 작동되는
순서로 대체하면서 확인을 한다.

: 만약 인라인 필터나 가드 컬럼에서 문제가 발생한다면 다른 것으로 대체하는것이 좋다.

: 분석 컬럼이 막혀 있다면, 컬럼의 막힘을 뚫거나 주입 프릿을 교체한다. 

  이러한 과정으로 문제점이 해결되지 않을 경우 분석 컬럼을 교체하시오.

: 압력의 문제가 계속적으로 지속될 때, 디텍터로부터 시작하여, 동시에 모든 연결된 프릿을 풀어주는 방식으로 압력이
떨어질 때까지 상위로 작업을 수행한다. 이것은 문제를 야기시키는 구성요소나 피팅을 찾아내는데 도움을 준다.

: 튜빙이 끝이 깨끗하고 불순물이 없는 지를 확인한다. 튜빙을 제대로 자르지 못해 발생된 금속 단편이 방해물이

  되어 압력의 상승을 발생시킬수 있다.

(3) Buffer

시스템 내의 buffer의 침전으로 발생되는 salt(=염)은 압력의 증가를 야기한다.

이러한 현상은 이동상이 50%가 넘은 유기 농도를 가지고 있을 때 자주 발생한다.

만일 buffer가 침전 되었다고 의심이 생긴다면,

        : 컬럼 제거후 5% 유기 수용성 이동상을 낮은 유속으로 흘려주어 세척해주면 된다.

        : 시스템의 압력이 안정화 된 후, 컬럼을 다시 장착하고 동일한 세척 용매를 사용하여

          낮은 유속으로 완전히 세척한다.

        : 그 후 표준 이동상을 이용하여 시스템을 재-평형 시킨 후, 분석을 시작하면 된다.

이동상을 먼저 섞어주거나 필터링 하는 것은 이러한 버퍼의 침전을 막아 줄 수 있다.

많은 경우 버퍼 침전은 값비싼 컬럼에 심각한 손상을 입히기 때문에 일반적으로 버퍼의 침전을 유발시키는 조건은
사용하지 않는 것이 좋다.

(4) 누수

너무 낮은 압력은 누수의 유무, 유속의 감소, 또는 시스템 구성요소의 문제를 나타내는 지표이다.

먼저 시스템에서 누수가 있는지 확인하고 용매 전달 속도 설정이 올바른지를 확인한다.

적당한 유속과 펌프가 잘 작동되고 있는지, in-line 유속 측정기나 detector에서 나오는 실린더가 채워짐으로,
또는 측정된 시간 간격에 맞는 양의 이동상을 측정할 수 있는 컬럼의 outlet에서 확인할 수 있다.

( Note: 컬럼이 연결되어 있지 않는 시스템에서 유속을 측정하는 것은 옳지 않을 수 있다. 대부분의 고압 펌프는
valve가 제대고 작동하는지 확인하기 위해 어느정도의 부하를 필요로 하기 때문이다.)

만일 측정한 유속이 틀림 없다면, 이동상의 조성을 확인한다. 잘못된 유기 함량이나 잘못된 유기 용매
- 예를 들어 Metahnol보다 Acetonitrile은 압력의 감소를 유발할 수 있다. - 는 압력의 저하를 유발할 수 있다.

(5) 컬럼

컬럼의 문제는 압력을 낮추기 보다는 일반적으로 압력을 높이게된다.

그러나 압력이 낮아지는 경우가 발생하게 되면, 컬럼의 in-let 프릿을 제거하거나 충진제의 손실이 있는지를
확인해야 한다. 만약 이런 일이 나타난다면, 컬럼을 교체해야 한다.

(6) 이동상

만약 측정한 유속이 너무 낮다면, 펌프에 이동상이 모두 소모됐는지를 확인한다.

용매 저장장치에 있는 프릿이나 펌프에 있는 인렛 프릿이 막히지 않았는지 확인하시오. 또한 이동상 저장
용기가 강하게 막혀있지 않게 해야 하며, 펌프의 인렛보다 낮아야 함을 확인해야 한다.

(7) 공기방울

펌프의 인렛라인에 공기 방울이 있는지 확인 해야 하며 만일 공기방울이 있을 경우 펌프에서 제거해야 한다.

이동상안의 기체는 펌프에서 공기 방울을 생성시킬 수 있는데, 특히 low pressure mixing gradient system에서
유속과 압력을 일정하지 않게 한다.

이러한 문제점을 방지하기 위해서 모든 용매는 기체제거 (degassing)를 해야하며, 최근에는
sonication, vaccum filter 헬륨 가스, 또는 in-line vaccum degassor를 이용하고 있다.

(8) 펌프

완전히 기체를 제거한 용매를 이용하여 권장되고 있는 과정을 따라서 펌프를 세척하고 주입한다.

만일 이런 과정으로 문제점을 해결하지 못한다면, 펌프 체크 벨브를 교체하여야 한다.

물 또는 미립자 오염은 체크 벨브의 작동에 문제를 발생시킨다. 인렛, 아웃렛 체크 벨브 모두 이러한 문제를
야기시킬수 있다.  마개의 누수가 감지되거나 압력이 계속적으로 반복되거나 이상하게 나타난다면

펌프 마개를 바꾸어야 한다.

(Note: seal-washing디자인으로 제작된 펌프에서는 seal-leakge가 펌프안에서 발생할 수 있다.)