1. 컬럼 선택시 주의사항

2. 컬럼 사용시 주의사항

3. 용매 사용시 주의사항

4. 샘플 사용시 주의사항

5. Column conditioning

6. 압력과 온도의 조절

7. 성능 테스트

8. 화학적 안정성

9. 추천 Elution 조건

10. 세척제 및 다른 화학제품

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1. 컬럼 선택시 주의사항

HPLC 컬럼의 수명과 성능을 극대화하기 위해서는 컬럼의 관리와 유지가 가장 중요하다.

관리하는 방법은 HPLC method와 분석되는 sample의 특성에 따라 정해지며,

보통 대부분의 컬럼이 역상 크로마토그래피로 분석됨으로 이를 중심으로 설명하려 한다.

정상적인 HPLC 컬럼은 아래의 조건을 가진다

   1. 피크 모양 : 좌우대칭(symmetry), Tailing/Shoulder/Split 미발생 등

   2. 피크 넓이

   3. 반복 실험시 Retention time의 재현성

   4. 적당한 압력

   5. 분석하고자 하는 물질의 만족할 만한 resolution

   6. 안정적인 Base line

이러한 조건 중 하나라도 기준치에 맞지 않다면 컬럼에 문제가 있는 것이며,

가끔 다른 system의 문제 발생할 가능성도 있다.

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2. 컬럼 사용시 주의사항

1. 컬럼에는 일정한 Flow 방향이 정해져 있다.

   이러한 방향을 지키지 않을 경우 여러 가지 문제가 발생할 가능성이 있다.

2. Fitlering

(1) Filtering

    컬럼의 수명을 증가시키기 위해서, 모든 용매와 분석물을 Filtering 해준다.

    일반적으로 0.45um의 membrane filter를 사용하며,

    사용하는 용매에 맞는 재질을 선택한다.

(2) In-line filter

    Solvent delivery system과 injector사이에 있는 in-line filter는

    이동상과 펌프 및 믹서에서 나온 불순물들을 제거해서

    컬럼과 injector 모두를 보호해준다.

    컬럼 인렛 필터 (Grace Vydac, P/N CPF10, 10ea/pk)는

    Injector와 시료에서 파생되는 입자들로부터 컬럼을 보호하는 것에 도움을 준다.

(3) Guard column

    컬럼과 같은 재질의 가드컬럼을 사용하는 것이 필요하다.

    가드 컬럼을 사용함으로서 컬럼 inlet을 막는 불용성 물질과

    강한 흡착물질들을 제거 할 수 있다.

3. 안정화 (Equilibrium)

(1) 컬럼 안정화

    최초 컬럼 설치 후 반드시 이동상으로 안정화 시켜주어야 한다. 

    이러한 과정은 거쳐야 컬럼에 최초로 저장되어있는 용매와 사용하는 이동상이 섞일 수 있게 해준다.

    (유기용매와 수용성용매 혼합시에는 Iso-propyl alcohol을 사용한다.

     Iso-propyl alcohol은 유기용매와 수용성 용매의 중간 혼합역활을 할 수 있다.)

    시료를 주입하기 전에 최소 컬럼부피 10배 이상의 이동상을 컬럼에 흘려주어 평형화시킨다.

     ex) 4.6mm기준 10.3ml -> 10배 = 100mL -> 1ml/min 기준 1.5-2시간

(2) Buffer 사용시

    이동상을 Buffer로 사용하는 경우,

    이동상을 흘려주기 전에 Buffer가 없는 이동상으로 컬럼을 충분히 세척해야 한다. 

    이러한 과정을 해야 Buffer가 컬럼이나 HPLC시스템에서 침전되는 것을 방지할 수 있다.

    만일 ion-paring reagent를 사용하는 경우 평형시간을 더 길게 하는 것이 좋다.

4. Column end-fitting, Tubing nut, ferrule은 컬럼에 적합한 것을 사용해야 한다.

    적합하지 않는 fitting등으로 연결한 경우 누수, 시료의 손실, 컬럼손상 등이 발생할 수 있다.

5. Ferrule을 지나치게 세게 조이면 안된다.

    너무 세게 조일 경우 ferrule의 모양을 변형시켜 누수가 발생하거나

    시스템에 불필요한 부피(Dead volume)를 추가시키게 된다.

    먼저 손으로 조인 후, 렌치와 같은 도구를 사용하여 1/4-1/2 회전 정도를 더 조인다.

6. 컬럼에 물리적인 충격을 주거나 떨어뜨리지 않도록 주의해야 한다.

    물리적인 충격은 컬럼에 비공간(Void)나 터널을 생기게 할 수 있다.

    이러한 영향은 피크의 tailing을 발생시키고 효율을 감소시킨다.

7. “유속(압력), 용출 조성, 컬럼온도”를 갑자기 변화시키면 안된다.

    이러한 물리적, 온도적 변화는 컬럼의 부피를 변화시켜서

    컬럼 내 빈공간(void), 터널, 피크 끌림 등이 생기며 효율성을 감소시킬 수 있다.

8. 높은 역압을 주의한다. 압력이 너무 높을 경우 컬럼내에 터널이나 비공간이 생길 수 있다.

    컬럼의 최대권장 압력과 같은 주의사항을 참고한다.

9. 컬럼 사용을 마친 후 보관하기 전에 buffer나 ion-paring시약과 같은 것들을 물로 완전히 제거해야

    흡착제의 분해나 buffer의 침전 등을 방지할 수 있다.

    컬럼 구입시 최초 저장된 solvent로 컬럼 내부를 채워야 하며,

    역상 컬럼의 경우 최소 50% 이상의 Acetonitilre을 포함한 Water 혼합 용매를 사용하여 보관한다.

    주의할 점은 반드시 저장 용매가 이동상과 혼합될 수 있어야 한다.

    사용한 컬럼에 저장 용매, 사용날짜, 그리고 마지막 사용 방법을 기록해 두어야 한다.

10. 컬럼의 End-plug가 꽉 조여져 있는지를 확인한다.

    End-plug가 느슨할 경우 내부 solvent가 증발하여 컬럼 성능에 안 좋은 영향을 끼칠 수 있다.