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RP-HPLC Column Trouble-Shooting

작성자 : 충인과학

Date : 2015-07-28 11:27 | Hit : 994

< RP-HPLC Column Trouble-Shooting >

컬럼의 performance는 여러 가지 요인에 의해 저하될 수가 있습니다.
(높은 pH등과 같은 부적절한 eluent, 샘플성분의 강한 흡착,
용매나 샘플내의 용해되지 않는 물질, 실험 미숙, 과다 사용 등)

다음은 RP-HPLC column 수행능력 복구를 위한 몇가지 제안입니다.

1) High back pressure

  우선 back pressure의 요인이 HPLC system이 아니라, 컬럼에서 비롯됨을 입증하기
  위하여 injector에서 컬럼을 떼어낸후 pump를 흘려줍니다.
만약에 컬럼의 back pressure가 높다면, inlet frit 으로부터 오염물이 밖으로 나올수
있도록 역방향으로 세척해야 합니다. 역방향으로 0.5mL/min 정도의 낮은 유속으로
  씻어내기 시작하여 10-15분이 지나면, 1.5-2.0mL/min으로 flow rate를
  증가시킵니다.(4.6mm ID 컬럼 기준)

2) Contaminated column

  column 의 10-20배 volume으로 고유기 용매를 강하게 흘려주거나, 2-3 "blank"
  (샘플 주입없이) gradient로 흘리면서 덜 강하게 흡착된 오염물을 제거하기 위해
  washing해 줍니다.

3) Protein contamination

컬럼 수행능력 저하의 요인이 흡착된 protein때문이라고 여겨지는 경우에는, 모든 polymeric bonded column(214TP, 214MS, 218TP, 218MS..)을 one part 0.1N nitric acid와 four parts isopropanol의 mixture로 헹구어줍니다. 일반적으로 낮은 유속으로(보통 20%) 하룻밤 내내 흘려주는 것이 효과적입니다.
* 이때 238TP, "monomeric" 역상 컬럼은 nitric acid로 씻어내면 안되는 점을 주의 *

4)  Lipids or other very hydrophobic contaminants

만약 지질이나 매우 소수성인 작은 분자가 컬럼 수행변화의 원인이라면, dichloromethane이나 chloroform을 column volume의 몇 배로 헹구는 방법이 있습니다. water에서 dichloromethane이나 chloroform으로 변화시키거나 다시 돌아갈때, 잘 섞이지 않는 두 물질 사이에, 서로 잘 섞이는 isopropanol이나
acetone같은 중간용매로 씻어주는 것이 중요합니다.

5) Spurious-"ghost"-peaks

HPLC chromatogram에서 간혹 예기치 못한 peak가 나올때가 있습니다. 이것은 solvent의 소수성 오염물에서 일반적으로 비롯되는데, 오염물은 water나 ion-pairing agent,혹은  buffer에 존재하며, 평형을 이룰동안 컬럼에 축적되어, gradient를 걸면 ghost peak로 나타납니다.

이것은 두가지 gradient를 흘려줌으로서 쉽게 원인을 밝힐 수 있습니다. 하나는 상대적으로 긴평형(30분)을 걸어주는 것이고, 두 번째는 짧게(10분) 걸어주는 방법을 권장합니다.

만얄 ghost peak가 용매의 오염물에서 비롯된 것이라면, 평형이 짧을 경우, 긴 평형에서
보다 작은 ghost peak를 지닐 것입니다. 왜냐하면 컬럼상에 적은량의 오염물이 짧은 평형동안 흡착하기 때문입니다. 문제를 정확히 하기위해서는, 순도가 더욱 높거나 신선한 water나 ion pairing agent, 혹은
buffer를 사용해야합니다.