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The Care of Reversed-Phase Columns
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작성자 :
충인과학
Date : 2015-07-28 11:27 | Hit : 637
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< The Care of Reversed-Phase Columns >
역상 HPLC 컬럼은 적절히 사용하기만 한다면, samle preparation이나, elution 상태에 따라 최대 천번
이상의 시료주입이 가능합니다. 다음은 Vydac RP-HPLC 컬럼에 관한 내용이지만, 다른 대부분의 RP-
HPLC 컬럼에 적용시켜도 좋을 사항들입니다.
* Column Protection *
컬럼의 수명은 사용 조건에 따라 차이가 있으므로, 용매와 샘플의 filtering과 eluent filter와 guard column을 사용하여 연장시킬 수 있습니다. solvent pump, mixing chamber로부터의 잔해를 포획하기 위하여, Solvent delivery system과 injector 사이에 eluent filter를 사용할 것을 권장합니다. 또한 만일 샘플에 용해되지 않는 성분이 들어있거나, material에 흡착되는 compound를 포함한다면, injector와 컬럼 사이에 guard column을 사용할 것을 권장합니다.
* Column Conditioning *
역상표면의 특성상, 컬럼의 분리능이나 수명은 처음 몇번의 protein injection동안 조금 변할 수가 있습니다. 컬럼이 특성이 잡힐때까지 반복적으로 protein을 주입하거나, 혹은
ribonuclease와 같은 단백질을 100ug 주입하고, Acetonitrile/0.1% TFA gradient로 흘려줌으로써 컬럼의 상태를 조절할 수 있습니다.
* Column Storage *
RP-HPLC 컬럼은 유기용매나 water에 보관할 수 있습니다. 오랫동안 보관하기 위해서는 ion pairing agent나 buffer를 컬럼에서 씻어내야하며, organic content가 적어도 50% 되어야합니다.
* Chemical Stability *
RP-HPLC 컬럼은 일반적인 유기용매인 Acetonitrile, Ethanol, Isopropanol,
Dichloromethane 등에서 안정합니다. solvent를 교체할 때, 섞일수 있는 solvent만을 차례로 사용하는 것이 중요합니다. Silica-based RP-HPLC column은 pH 6.5-7에서 안정하며, SDS(Sodium Dodecyl Sulfate)와 같은 일반적인 protein detergent에도 해를입지 않습니다.
* Pressure and Temperature Limits *
RP-HPLC column은 일반적으로 60℃와 5000psi(335bar) back-pressure에서 안정합니다.
RP-HPLC column의 전형적인 back pressure는 다음과 같습니다.
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Column size(mm) Flow Rate(mL/min) Typical Back-pressure
(with 50:50 ACN:Water)
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2.1 x 250 0.20 1000-1800 psi
4.6 x 250 1.0 1000-1800 psi
4.6 x 150 1.0 600-1200 psi
10 x 250 5.0 1000-1800 psi
4.6 x 250 1.0 500-1000 psi
10 x 250 5.0 500-1000 psi
22 x 250 25.0 500-1000 psi
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