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** Vydac Protein/Peptide column Care **
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작성자 :
충인과학
Date : 2015-07-28 16:58 | Hit : 849
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< Vydac Protein/Peptide Reversed-Phase Columns >
- FOR 208TP, 214MS, 214TP, 218MS, 218TP, 219TP, 228TP, 238TP -
238TP를 제외하고는 Vydac silica-based Protein/Peptide Reversed-Phase Column은 multifunctional chlorosilane을 통하여 300Å TP silica와 화학적으로 결합된 hydrocarbon compounds로 구성되어 있다. 'polymeric' 역상은 hydrolysis를 방지한다.
Vydac 238TP 역상은 monomeric C18 phase로서, polymeric과 선별성에 있어 미묘한 차이를 나타내어, Protein/Peptide 분자의 최적화를 돕는다. 238TP 컬럼은 철저하게 end-capping되어 있다.
* Performance testing *
각각의 reversed-phase material은 protein과 peptide로 선별성 테스트를 거친 것이다. (219TP는 protein만, 238TP는 peptide만)
각각의 컬럼은 제각기 biphenyl이나 benzoate ester를 사용하여 packing efficiency test를 거친다. (biphenyl : analytical column / benzoate ester : prep column) 테스트 조건과 결과는 column documentation에 포함되어 있다. column performance를 test해 보거나, 확인해 보고싶다면, selectivity, efficiency test를 다시 한번 해볼 것을 권장한다.
* Shipping *
Vydac Protein/Peptide Reversed-Phase Column은 50:50 ACN:Water로 shipping된다.
Prep column은 Methanol : Water로 shipping된다.
* Column conditioning *
역상 표면의 특징으로 인하여, polypeptide의 초기 주입동안 column performance가 약간 변할 수 있다. Column conditioning은 10,000MW 이상의 대부분의 polypeptide에서 행해야 하며, 컬럼 성질이 일정해 질 때까지 polypeptide를 반복적으로 주입시키거나, ribonuclease와 같은 흔히 이용 가능한 protein을 100ug(4.6 x 250mm에서) 주입하여 조절된다. 그리고는 0.1% TFA의 전형적인 ACN gradient의 column elution을 진행한다.
* Column Storage *
Vydac Protein/Peptide Reversed-Phase Column은 유기용매와 water의 어떤 화합물에도 저장 가능하다. 장기적으로 저장할 경우 ion-pairing reagent가 컬럼에서 분출될 수가 있고, organic content는 적어도 50%로 유지되어야 한다. column은 제공되는 plastic plug로 봉합되어야 한다.
* Chemical Stability *
Vydac Protein/Peptide Reversed-Phase Column은 ACN, Methanol, IPA, M.C, Chloroform 등 대부분의 유기용매에 안정하다. Solvent를 교체할 때, 바뀌는 solvent가 이전에 사용한 solvent와 섞일 수 있는지 확인해 보는 것이 중요하다. Protein/Peptide Column은 hydrolysis를 방지하며, 0.1% TFA와 같은 pH2에서 오랫동안 사용될 수 있으며, pH2 이상에서 보관되었다면, 경우에 따라 더 낮은 pH에서도 안정하다.
Vydac silica-based HPLC column은 pH6.5 이상에서 사용하면 안된다. 사용하면 수명이 단축되기 쉽다.
basic elution 상태에서 사용해야 한다면, 259VHP polymer column을 권장한다. SDS(Sodium dodecyl sulfate)와 같은 protein detergent를 사용하여도 컬럼에 손상이 없으며, ACN이나 IPA로 제거가 가능하다. 그러나 detergent를 흘려주는 동안에는 컬럼의 resolution에 영향을 미친다. oxidative eluent나 sample additives는 피해야 한다.
* Recommended elution conditions *
Vydac Protein/Peptide Reversed-Phase Column은 전형적으로 ion-pairing agent가 있는 상태에서 organic solvent의 gradient를 증가시켜 가면서 elute 해준다. 가장 일반적인 유기 용매는 low viscosity, good UV transparency, high volatility를 지니는 Acetonitrile이다.
Ethanol이나 IPA도 경우에 따라 사용된다. Trifluoroacetic acid(TFA)는 가장 흔히 사용되는 ion-pairing reagent이며, 보통 0.05-0.2%(w/v)만 사용해도 된다. 다른 ion-pairing reagent로는 heptafluorobutyric acid (for base polypeptide), triethylamine phosphate(TEAP)와 phosphoric acid 등이다.
▶ Recommended elution conditions
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ID flow rate
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1.0mm 10-50uL/min
2.1mm 100-300uL/min
4.6mm 0.5-1.5uL/min
10mm 2.5-7.5uL/min
22mm 10-40uL/min
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* Column Cleaning and Regeneration *
Vydac Protein/Peptide Reversed-Phase Column에 샘플이 강하게 흡착되어 오염되면, 다음과 같은 방법으로 해결해 본다.
◆ 1% SDS solution을 500uL 주입하여 1mL/min으로 흘려준다. (4.6mmID 경우)
0.1%(v/v) TFA의 ACN을 5%∼95%로 10분간 gradient하여 흘려준다.
◆ 만일 지질이나 매우 소수성인 작은 분자가 원인이라면, 컬럼의 몇 배 volume으로
Dichloromethane이나 Chloroform으로 rinse해 준다. water에서 chloroform이나 M.C.로
바꾸거나 그 역방향으로 바꾸는 경우에는 잘 섞이지 않는 두 용매 사이에 IPA이나
acetone과 같은 상호간에 섞이는 중간 용매로 컬럼을 rinse해 주는 것이 중요하다.
◆ 만일 단백질 흡착 때문이라면, one part nitric acid와 four parts(1/4) IPA의 혼합물로
polymeric-bonded column을 rinse한다. low flow rate에서(보통 20%) 밤새 rinse
해 주는 것이 가장 효과적이다.
( ※ 238TP 'monomeric' column은 nitric acid 사용하면 안됨을 주의 )
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