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HPLC PEAK 관련 자주 묻는 질문들

작성자 : 충인과학

Date : 2015-07-28 17:02 | Hit : 3,212

1.        Q.  Retention time이 바뀌는 원인은?

           A.        컬럼이 오염되었거나 컬럼 내 손상이 생긴 경우 Retention time이 바뀌게 된다. 이 때는 컬럼을 잘 세척하거나 컬럼을 교환해 주어야 한다. 아니면 컬럼의 Equilibration이 잘 이루어지지 않았거나 샘플이 너무 많이 주입 되었을 수도 있다.


2.        Q.  Peak splitting 현상이 일어나는 원인은?

           A.        먼저 혼합물이 제대로 분리되지 않아 이러한 현상이 나타날 수가 있다.
이 경우가 아니라면 몇 가지 원인을 생각해볼 수가 있으며, 해결 방법은 다음과 같다.
a.        컬럼이 오염되었을 경우 : 컬럼을 세척하거나 교환한다.
b.        컬럼에 미세 입자들이 걸려 있을 경우 : 컬럼을 거꾸로 연결하여 용매를 흘리던가 inlet frit을 바꾸어 본다.
c.        컬럼에 빈 공간이 생긴 경우 : 컬럼 내부를 채우거나 컬럼 교체
이외에도 컬럼 내 volume이 너무 큰 경우, sample 주입량이 너무 큰 경우 등이 원인이 될 수 있으며, 이동상의 첨가물,  pH 나 buffer 농도 등을 점검해 보는 것도 좋은 방법이 된다.

3.        Q.  baseline spiking 의 원인은?

          A.        보통 flowcell 내부에 공기방울이 들어갔을 때 나타난다. 펌프를 멈추었을 때, spike도 멈추면 공기방울이 원인인 것이 확실하므로, purge를 하여 공기방울을 빼내어 주면 된다.
만약 펌프가 멈추었는데도 계속 같은 현상이 일어나면 detector의 전기적 noise가 원인일 가능성이 크다. 이때는 detector를 구입한 대리점으로 연락하여 점검을 받는 것이 좋다.

4.        Q.  baseline drift 현상의 원인과 해결책은?

           A.        양의 방향으로 drift가 일어나면 시스템 어딘가가 오염되어 있을 가능성이 크다. 컬럼을 깨끗이 하고, 샘플과 용매를 새 것으로 교체해 본다.
음의 방향의 drift는 실험실 온도가 안정하지 못하거나 컬럼 자체의 온도가 일정하지 못하여 일어나는 경우가 많다. 실내 온도를 안정시키고 컬럼을 보온한다. 도한 UV-wave를 흡수하는 특정 용매가 음의 방향으로 drift를 일으키기도 한다.

5.        Q.      Negative Peak

          A.       negative peak는 calibration이 올바르지 않거나, 이동상은 분석물 보다 더 높은 UV흡수 혹은 굴절률을 지니거나, 시료 용매의 굴절률이 이동상과 너무 많은 차이를 보일 때 나타나기 쉽다. 이것은 electronical noise가 아니다
<  해결 방안  >
a.        0uL 주입 실시 : 만약 negative peak가 보인다면, 시료 용매는 이동상보다 흡수가 덜하거나 굴절률이 아주 크게 나타나기 때문이다. 모든 이동상 요소들을 바꾸고 분석물의 파장에 흡수가 없어야 한다.
b.        시료 용매만 주입 : 만약 negative peak가 보이지 않는다면, 시료 용매는 이동상보다 흡수가 덜하거나 굴절률이 아주 크게 나타나는 요소가 있기 때문이다

6.        Q.    ghost peak가 나오는 이유는 무엇이며 그 해결책은?

           A.    ghost peak는 그 전 실험의 샘플이 시스템 내부에 남아 있었다던가 용매나 샘플이 오염되었을 경우 나타날 수 있다.
이를 예방하기 위해서는 실험 전후에 강한 용제로 충분히 washing 해주고, 컬럼이 오염되지 않도록 잘 보관하며, 시스템에 bubble이 들어가지 않도록 잘 degassing된 용매를 사용해야 한다.

엄정하게 0uL 주입을 실시하였을 때,
a.        피크가 감소한다면  :  오염은 이전 시료 주입에서 기인한다. 전체 시스템을 Isopropanol로 cleaning로 크리닝 한다. 분리된 시스템에서는 컬럼의 크리닝 또는 재생 순서를 따르며, 나중에 용출 된 화합물을 제거하기 위해 실행부분의 말단에 강한 용매를 흘려준다.
b.        피크가 동일한 size로 유지된다면 :  오염은 이동상에서 기인한다. 전체 시스템을 Isopropanol로 cleaning로 크리닝 한다. 분리된 시스템에서는 컬럼의 크리닝 또는 재생 순서를 따르며 각 이동상의 요소들을 교체하여 펌프를 체크하여 오일이 라인 안으로 누수되는 것을 방지한다.
c.        피크를 찾을 수 없다면, 시료 안에 ghost peak가 있다. 나중에 용출 된 화합물을 제거하기 위해 실행부분의 말단에 강한 용매를 흘려준다.
시료는 꼭 필터링하여 모든 요소들이 이동상과 용매에 용해될 수 있게한다.

7.        Q.    baseline noise를 줄이려면?

           A.    일반적으로 baseline noise가 발생하는 것은 시스템 내부가 오염된 것이 원인일 수 있다. 컬럼 및 system을 충분히 washing 해준다.
그래도 계속 noise가 발생한다면 , flow 나 detector에 문제가 있을 수 있다.

8.        Q.     Peak tailing 이 일어나는 이유는?

           A.     dead volume 때문이거나 sample이 흡착되어 있는 경우, column의 수명이 다한 경우 등이 있다. 각 연결 부분을 단단히 조이거나 더 강한 용매를 써 본다.
컬럼을 바꾸어 보는 것도 방법이다.

9.        Q.    High back pressure

          A.    우선 back pressure의 요인이 HPLC system이 아니라, 컬럼에서 비롯됨을 입증
   하기  위하여 injector에서 컬럼을 떼어낸 후 pump를 흘려준다.
만약에 컬럼의 back pressure가 높다면, inlet frit으로부터 오염 물이 밖으로 나올 수 있도록 역 방향으로 세척해야 한다. 역 방향으로 0.5mL/min 정도의 낮은 유속으로  씻어내기 시작하여 10-15분이 지나면, 1.5-2.0mL/min으로 flow rate를  증가시킨다.(4.6mm ID 컬럼 기준)

<   참 고  >
“ 자료실 내용 중 2002년 11월 25일 날짜의 “ RP-HPLC column trouble shooting ” 내용을 보시면 좀 더 추가적인 정보를 얻을 수 있습니다 ”